Nos plateformes et nos plateaux techniques

La plate-forme LIGAN Médecine personnalisée

CNRS UMR 8199

INSTITUT DE BIOLOGIE DE LILLE
1, rue du Professeur Calmette
59000 Lille, France

Tel : +33 (0)3 20 87 10 44

Cette plate-forme est implantée dans les locaux de l'UMR 8199. Visitez son site pour en appendre davantage.

Des équipements à l'état de l'art

Le plateau technique « ImmunoPhénotypage Métabolique » est un plateau de cytométrie, au sein d’EGID et de l’UMR 1011, dédié à l’étude  des cellules immunitaires au sein des organes métaboliques (foie, tissus adipeux, muscle) et dans les pathologies cardiométaboliques et leurs complications vasculaires (obésité, diabète de type 2, athérosclérose, stéatose hépatique…).

Aussi, le personnel du plateau possède une expertise à la fois en cytométrie en flux, incluant analyse et tri cellulaire, en cytométrie de masse, et en analyses et tests métaboliques (tests de tolérance, clamp, intégration des résultats dans un contexte immunométabolique).

Le plateau s’est équipé au cours de l’année 2015 de trois instruments complémentaires pour l’analyse du phénotype cellulaire et le tri des cellules d’intérêt :

- Un cytomètre analyseur BD LSRFORTESSA X-20 (Becton Dickinson®1), dernière génération d’analyseur multi-couleurs à haute-performance permettant l’acquisition simultanée de 18 paramètres de fluorescence et 2 paramètres de structure.


- Un cytomètre trieur de cellules BD INFLUX (Becton Dickinson®2), trieur « jet in air » multi-couleurs à haute-performance et haut débit permettant l’acquisition simultanée de 21 paramètres de fluorescence et 2 paramètres de structure. Très flexible et adaptable aux contraintes spécifiques des utilisateurs, unique dans le Nord de la France, cet instrument est un des seuls à proposer 6 voies de tri simultanées, extrêmement intéressant pour l’utilisation optimale d’échantillons tissulaires précieux.


- Un cytomètre de masse CyTOF 2 (Fluidigm®1), une véritable innovation à la frontière entre cytométrie et protéomique, cette technologie unique permet l’analyse simultanée de plus de 40 paramètres (isotopes métalliques stables) à l’échelle de la cellule individuelle grâce au couplage entre la cytométrie et la spectrométrie de masse.


- Un poste d’analyse des données de cytométrie équipé de logiciels adaptés au traitement de données de cytométrie classiques (FlowJo®, FACSDiva®) et multi-paramètriques (Cytobank®, Cytofkit sous R).

Comité de pilotage du plateau

Fonction Nom Téléphone Mèl
Directeur Bart Staels 33 (0) 20 87 73 88 bart.staels@pasteur-lille.fr
Coordinateur EGID Dominique Pacot 33 (0) 3 20 97 42 51 dominique.pacot@univ-lille2.fr
Responsable scientifique David Dombrowicz 33 (0) 20 87 79 67 david.dombrowicz@pasteur-lille.fr
Responsable technique Olivier Molendi-Coste 33 (0) 20 87 77 57 olivier.molendi-coste@inserm.fr
Ingénieurs de recherche Laurent Pineau & Olivier Molendi-Coste 33 (0) 20 87 77 57 33 / (0) 20 87 77 57 laurent.pineau@inserm.fr / olivier.molendi-coste@inserm.fr

Nos équipements

Cytomètre analyseur BD LSRFORTESSA X-20

(Becton Dickinson®1)

 Dernière génération d’analyseur multi-couleurs à haute-performance, il est équipé de 5 lasers, permettant au total l’analyse simultanée 2 paramètres physiques (taille/FSC et structure/SSC) et 18 paramètres de fluorescence (lien vers la configuration optique du FORTESSA X20).

 

Sa configuration électronique permet l’acquisition de plusieurs millions d’événements à une vitesse maximale de 20 000 evts/seconde.

La conception des systèmes d’acquisition des signaux de taille/structure (amplificateur sur le FSC) et de la fluidique du système de prélèvement d’échantillon (sample line) permet d’analyser des entités cellulaires allant d’une très petite taille, à partir de 0.1µm de diamètre (telles que des bactéries), jusqu’à 40-50 µm de diamètre.

Les spécifications techniques du FORTESSA X20 sont accessibles grâce à ce lien : cliquez ici.

D’utilisation simple, l’accès au FORTESSA X20 est validé par le personnel technique du plateau après une formation individuelle de 3 heures. Pour accéder au site de réservation, cliquez ici.

Trieur de cellules BD INFLUX

(Becton Dickinson®)

Ce trieur « jet in air » est hautement modulable, le contrôle étant totalement manuel, ce qui permet d’adapter sa configuration aux besoins et contraintes spécifiques des utilisateurs. Par ailleurs, la configuration du système informatique en données digitales offre un meilleur contrôle de la qualité d’acquisition et du traitement des signaux lumineux acquis.

Il s’agit d’un appareil multi-couleurs à haute-performance et haut débit (20 000 evts/seconde), équipé de 5 lasers et qui permet l’acquisition simultanée de 2 paramètres de structure (taille/FSC et structure/SSC) et 21 paramètres de fluorescence (lien vers la configuration optique de l’INFLUX). Globalement, la configuration optique de ce trieur est proche de celle du FORTESSA X20, ce qui permet d’appliquer pour le tri cellulaire une stratégie de marquage mise au point sur l’analyseur.

Le principe du « jet in air » permet une meilleure préservation de l’intégrité cellulaire par rapport à un trieur classique, tout en conservant un débit et une sensibilité de détection équivalents, notamment grâce à la réduction de la pression hydrostatique appliquée aux cellules.

Unique dans le Nord de la France, cet instrument est un des seuls à proposer 6 voies de tri simultanées, ce qui permet, sur un échantillon donné, de récupérer 6 populations distinctes définies par le marquage. Idéal donc pour une analyse intégrative d’échantillons précieux. Il est aussi possible de réaliser les tris en plaques 96 puits en configuration « cellule unique ». Toutes les configurations de tri sont accompagnées de la possibilité d’adapter la température du réceptacle (de 4 à 27°C) pour une meilleure préservation de l’échantillon.

La conception des systèmes d’acquisition des signaux de taille/structure (amplificateur sur le FSC) permet d’analyser des entités cellulaires d’une très petite taille, à partir de 0.1µm de diamètre (telles que des bactéries). Par ailleurs, et parmi les nombreux avantages de cet instrument, la conception du système fluidique de prélèvement d’échantillons (sample line) et de sortie du jet (buse) permettent de manipuler des cellules allant jusqu’à 100 µm de diamètre, là où les trieurs (et analyseurs) classiques sont limités à 50-60 µm.

Les spécifications techniques de l’INFLUX sont accessibles grâce à ce lien : cliquez ici

D’une utilisation complexe, les acquisitions et tris avec l’INFLUX sont réalisés par le personnel technique du plateau après 1) validation du panel et de la stratégie de tri lors d’une discussion et 2) validation expérimentale des marquages. Prenez contact avec les « Ingénieurs-Trieurs » ici.

Cytomètre de masse CyTOF II

(Fluidigm®)

La cytométrie de masse, concrétisée en 2009 par la sortie sur le marché du CyTOF I, constitue une véritable innovation à la frontière entre cytométrie et protéomique.

Dans la cytométrie de masse, les anticorps et les sondes utilisées pour identifier une cible précise sont couplés à des isotopes métalliques stables (non radioactifs) hautement purifiés, qui possèdent chacun une masse atomique relative précise (Dalton, Da). Les cellules marquées sont injectées dans un système comparable à celui d’un cytomètre (le « Cy » de CyTOF) qui  prélève et achemine les cellules une par une. Elles sont ensuite vaporisées en nuages d’ions qui sont injectés un par un dans un spectromètre de masse « par temps de vol » (« Time of flight », d’où le « TOF » de CyTOF) qui identifie chaque ion métallique présent dans le nuage selon son temps de vol, proportionnel à sa masse atomique relative. Le signal est, pour chaque masse atomique, proportionnel à l’abondance des ions et donc du marqueur spécifique. La largeur de la fenêtre de détection du TOF du CyTOF II (de 80 à  200 Da) permet ainsi l’analyse simultanée, sur des millions de cellules individuelles, de plus de 40 paramètres en pratiques, et jusqu’à 120 en théorie. Schéma de fonctionnement

Les cibles peuvent être des marqueurs de surface, cytokines, facteurs de transcription, ARNm, métabolites pour autant que les sondes/anticorps puissent être couplés à des atomes lourds. A l’heure actuelle environ 40 marqueurs peuvent être analysés simultanément dans un échantillon. Illustration de données obtenues

Ce système de détection des marqueurs, notamment la stabilité d’identification des isotopes (masse unique) par le TOF et l’absence d’interférence entre isotopes, permet de s’affranchir des compensations classiques entre fluorochromes en cytométrie de flux. De plus, les métaux lourds utilisés sont extrêmement rares dans le monde vivant (hors cas particulier), le signal est donc quasiment dépourvu de bruits de fond.

Un outil en ligne a été développé par Fluidigm® afin d’aider à l’élaboration du panel d’anticorps optimal (photo panel designer). Cet outil permet d’évaluer pour chaque marqueur le couple « intensité d’expression de la cible/intensité de détection de l’isotope » afin d’optimiser la sensibilité de détection des cibles.

Les panels seront validés d’un point de vue théorique après discussion avec un des Ingénieurs du plateau, et les mises au point seront contrôlées jusqu’à finalisation du panel avant de procéder aux expériences complètes.

La technologie du cytomètre de masse ne permet un débit aussi important qu’en cytométrie de flux. En moyenne, il faut compter environ une heure d’utilisation pour acquérir 1 million d’événements.

D’utilisation complexe, les acquisitions avec le CyTOF II sont réalisées par le personnel technique du plateau. Prenez contact avec les « Ingénieurs-isotopiques » ici.

Station d'Analyse

Un ordinateur performant (i7, 16 Go de RAM, double écran) peut être réservé afin d’analyser les données de cytométrie.

Cet ordinateur est équipé des logiciels :

  • FlowJo (TreeStar®)
  • FACS Diva (Becton-Dickinson®)
  • R et Cytofkit (R foundation et « Chen et al. 2016 »)

Pour l’exploitation des données de cytométrie de masse, qui comportent la plupart du temps un grand nombre de paramètres, il est indispensable d’utiliser des logiciels d’analyse automatisée, avec algorithmes de réduction de dimension (illustration), de « clusterisation » (illustration) et d’identification automatique des populations (illustration). Pour ce faire, le poste d’analyse est équipé du module Cytofkit de R. Les ingénieurs de recherche du plateau disposent également d’une licence privée pour l’accès au logiciel en ligne CytoBank®, et ils pourront donc, avec vous, procéder à vos analyses à l’aide de ce logiciel. Ces logiciels permettent la mise en forme des données de cytométrie.

Pour accéder au site de réservation du poste d’analyse, cliquez ici.

Il est possible également de se faire assister d’un des ingénieurs de recherche du plateau pour prendre en main les logiciels, élaborer des stratégies d’analyse, réaliser les analyses.

Pour contacter les ingénieurs, cliquez ici.

Tarification

En cours de réalisation. Contactez nous pour en savoir davantage...

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RESERVATIONS

Pour accéder aux pages de réservation, il faut que le personnel du plateau valide votre accès et vous fournisse un identifiant et mot de passe. Après, suivez les liens ci-dessous :

FORTESSA : cliquez ici

Poste d’analyse : cliquez ici

Les partenaires et les soutiens de la plate-forme

Le plateau-technique a été acquis grâce à des fonds FEDER (européens) et à des contreparties issues du Laboratoire d'excellence EGID (ANR-10-LABX-46).

L'unité qui héberge la plate-forme est portée par l'INSERM, l'Université Lille 2 et l'Institut Pasteur de Lille.

Liens utiles

Outil d’équivalence des fluorochromes développé par BioLegende®.

Outils de visualisation des spectres d’excitation et d’émission des fluorochromes développés par différentes compagnies :